2019年10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领域（yù）取得重（chóng）要进展（zhǎn）。2型糖尿病（T2D）的血管并（bìng）发（fā）症是导致（zhì）2型糖尿病致（zhì）残（cán）致死的重要病（bìng）因，一直缺乏一种无创便捷的临床途径实现血管（guǎn）并发症的发生发展监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病人的（de）整体生活质量，减少卫生（shēng）经济负担。

该研究入组了62例（lì）2型糖（táng）尿病病（bìng）人，采用5hmC-Seal技术对血（xuè）浆cfDNA中表观遗传标志物5hmC的分布情况进行检测，分析5hmC标志（zhì）物与2型糖尿病血管并发症发生发展的相关性。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微（wēi）血管事件具有（yǒu）相关（guān）性，主要涉及一些与血管生物学和糖（táng）尿（niào）病（包括胰岛素耐受（shòu）和炎症反应）相关的基因和信（xìn）号通路。该研（yán）究建立的16个基因（yīn）-5hmC标志物组合检测可以准确（què）区分（fèn）有并发症和（hé）无并（bìng）发症的2型糖尿病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床变（biàn）量例如（rú）白（bái）蛋（dàn）白尿。除（chú）此之外，还建立了（le）13个基因-5hmC标志物（wù）组（zǔ）合检（jiǎn）测，可以进一步（bù）区分T2D合并单一并发（fā）症和多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于（yú）其他（tā）传（chuán）统临床变量。该研（yán）究得出结论（lùn），5hmC标志物反映（yìng）了T2D病人大血（xuè）管/微血管并（bìng）发（fā）症发生过程中（zhōng）的表观遗（yí）传变化，因而（ér）5hmC-Seal检测（cè）技术在（zài）监测糖尿病血管（guǎn）并发症发生和进（jìn）展（zhǎn）方面具有良（liáng）好的临床应用（yòng）前景。

本研究共纳入62例2型糖（táng）尿病（bìng）病人，包括没有血管并发症的病人12例（lì），有单一血管并发症的病人34例（24例发生大血管事件，10例（lì）发生微血（xuè）管事件），以及（jí）有多（duō）种血管（guǎn）并发症的（de）病人16例。试验（yàn）收集62例病人血浆，提取（qǔ）cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术（shù）捕获外周血cfDNA中的（de）5hmC序列，进行二代（dài）测序，通过（guò）生物信息学分（fèn）析找出并发（fā）症（zhèng）组与无并发症组（zǔ）之（zhī）间有显著（zhe）5hmC修（xiū）饰差异的基因，单一并发（fā）症组和多种（zhǒng）并（bìng）发症组之间有显著5hmC修饰差异的基因。随后利用回归模型对（duì）差异基因进一步筛选、优化（huà），弹性网络进一（yī）步筛选（xuǎn），计算加权平均分，最后得到一组具有高度灵敏度和特异性（xìng）的5hmC生物标（biāo）记物（wù），并进一（yī）步在实验组中验证，分析其灵敏度（dù）和特异性。并将新建（jiàn）立（lì）的5hmC标志（zhì）物基因组合（hé）的（de）检测性能与传统临床（chuáng）变（biàn）量进（jìn）行对比分析。最后对相关基因（yīn）进行了信（xìn）号通（tōng）路分析和（hé）功能探究。

5hmC修饰水平（píng）与血管并发症具有相（xiàng）关（guān）性（xìng）

利用逻辑回归模型对62例有（yǒu）并发症和无（wú）并发症2型糖（táng）尿（niào）病病人的（de）5hmC差异水平进行（háng）分（fèn）析发现，有并发症2型糖尿病病人的622个（gè）差异修饰候选基因（包括上调和下调基因）的归（guī）一化平均数（shù）要明显高于无并发（fā）症的病人（P<0.001），但是单一并发症（zhèng）和多发并发症病人之（zhī）间没有显著（zhe）差异。

之后将有单一（yī）并发症或多种并发症（zhèng）的（de）50例病人用逻辑回归模（mó）型（xíng）进行了对比（bǐ），发现（xiàn）多种并发症的病人的153个差异修饰候选基（jī）因（包括上调（diào）和下调基因）的归一化平均数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无并（bìng）发（fā）症患者

62例2型糖尿病病人（rén）被随机（jī）分成（chéng）训练组（n=31）和（hé）测试组（n=31）。利用弹（dàn）性网络筛选后发现，16基因-5hmC标志物组合检测可以用于区分（fèn）有并发症和无并发症的2型糖尿病（bìng）病人。

基于16基因组合模型（xíng） (Detection Model 1) 的加权平（píng）均分分析，发现无并发症病人的分数在训练集和测试集中都明显低于有并发（fā）症的（de）病人。只考虑加权平均分（fèn）的（de）话，受（shòu）试者工作（zuò）特征（zhēng）曲（qǔ）线（ROC）分析（xī）表明（míng）将cutoff值设（shè）置成0.5时（shí），在测试组中（zhōng）中的灵敏度为60%，特异性为（wéi）100%。

5hmC标志物（wù）可区分病人是单一并发症还是多种并发症

50例有并发症的2型糖尿病病人被随机分（fèn）成（chéng）训（xùn）练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网络（luò）筛选（xuǎn）后发现（xiàn），13基因-5hmC标志物组合可以区分2型糖尿病（bìng）病人是否发生（shēng）单一（yī）并发症或多种（zhǒng）并发症。

基于13基因组合（hé）模型 (Detection Model 2)， 我们计（jì）算了单一并（bìng）发症（zhèng）和（hé）多种（zhǒng）并发症（zhèng）的加权平均（jun1）分，发（fā）现在（zài）训练（liàn）集（jí）和（hé）测试集中单一并发症（zhèng）和多种并发症病（bìng）人（rén）的分数都有明显（xiǎn）差异。值（zhí）得一提的（de）是，有肾病并发症和无肾病并发症（zhèng）病人的分数也有明显（xiǎn）差（chà）异。利用加权平均分作为判断标准（zhǔn）的受（shòu）试者工（gōng）作特征（zhēng）曲线（ROC）表明，在（zài）测试组中当将cutoff值（zhí）设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性（xìng）为68.8%。

5hmC标（biāo）志物与传（chuán）统临床变量/危险因子的对比

我们评（píng）估了不同临床变量/危险因子用于监测血管并（bìng）发症的灵敏（mǐn）度和特异性（见表1）。

信号（hào）通路分析和功能探究（jiū）

有并发症和无并发症（zhèng）病人（rén）的（de）135个差异（yì）候选基因的功能注释分析表（biǎo）明，这些基（jī）因主要富集在一些经典的（de）信号（hào）通路。错（cuò）误发现率相关（guān）P值位于前10%和基因数（shù）目（mù）≥3的信号通路包括由（yóu）IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路（lù）。由（yóu）IGF1R和IL-10介导的信号通路与胰岛素（sù）抵（dǐ）抗及炎症（zhèng）反（fǎn）应相关，在血管生物（wù）学和糖尿（niào）病发生发展过程中（zhōng）发挥（huī）重要作用。

Reactome相（xiàng）互作用网络的（de）中心表明，泛素编（biān）码（mǎ）基因[泛素B (UBB)，泛素（sù）C (UBC)，泛素A-52亚基核糖体蛋白（bái）融合（hé）产物1(UBA52)]是候（hòu）选基（jī）因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个差（chà）异候（hòu）选基（jī）因（yīn）中, 一（yī）些（xiē）基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关的倾向，表明5hmC和（hé）糖尿病血管并发症之间可能存在时间依赖性的相（xiàng）互作用。基于（yú）纵向时间（jiān）队列的大样本研究，将可（kě）进（jìn）一步（bù）明（míng）确（què）5hmC变化和（hé）糖尿病持续（xù）时间之间（jiān）的动态关联。关于（yú）单一并发症和多种并（bìng）发症病人的159个候选标志基因的功能注（zhù）释（shì）研究发现，存在细胞（bāo）-细胞（bāo）连接、胶原（yuán）蛋白形成、新陈代谢、细胞应激（jī）应答（dá）信号通路的富集，这些信号通路（lù）均与细胞基本功能密（mì）切相关。

血管并（bìng）发症是三分之二糖尿（niào）病病人的死（sǐ）亡原因，若能及早有效控制血（xuè）管并发症的（de）发生，将极大地改（gǎi）善（shàn）糖尿（niào）病病人（rén）的生存（cún）质量。该研究建立了（le）一种利用cfDNA进行2型糖尿病血管并发症监测的（de）无创便捷方法，较目前临床（chuáng）标志物能（néng）更准确地监控血管（guǎn）并（bìng）发（fā）症的发生，从（cóng）而提示临床及早（zǎo）采取应（yīng）对措施（shī），有效控制病情进展。